teknik menghiting mikroba ( ALT DAN MVN )

LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI I

TEKNIK MENGHITUNG MIKROBA

( ALT DAN MVN )

           

Disusun oleh :

Nama       :Diah Lestari Harahap

NPM         : 2013210055

Kelas       : F

Kelompok : II ( dua )

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITA PANCASILA

JAKARTA

T.A 2014

BAB I

PENDAHULUAN

A.     Latar belakang

Mikroba merupakan organisme yang sangat kecil. Untuk mengetahui banyaknya mikroba misalnya bakteri pada suatu sampel  sangat tidak mungkin bila kita tidak menggunakan metode penghitungan. Dalam dunia mikrobiologi, mikroba seperti bakteri dapat diperkirakan jumlahnya dengan suatu metode penghitungan. Perhitungan miroba terdiri dari dua metode yaitu metode langsung dan metode tidak langsung. Pada praktikum kali ini akan menggunakan metode langsung. Ada beberapa metode menghitung bakteri, antara lain metode lempeng, metode turbidimetri, metode APM/angka paling mungkin (MPN/Most Probable Number), metode membrane filtration, metode kimia, metode elektrik serta menghitung langsung dengan Petroff Hausser.

                 Pemahaman tentang satuan dalam menghitung sel mikroba khususnya sel bakteri adalah sangat penting. Perhitungan sel bakteri pada cawan dapat digunakan satuan CFU/ml atau mg. CFU singkatan dari Colony Forming Unit yang artinya unit-unit atau satuan pembentuk koloni. Sebelum menghitung sel mikroba dalam sampel, sebaiknya peneliti mempunyai kemampuan memprediksi cell density sebelum menganalisanya.Densitas sel sangat tergantung dengan jenis sampel. Dimana cara ini menggunakan berbagai jenis air sebagai bahan yang akan dipraktikkan.

Percobaan ini dilatarbelakangi oleh perhitungan jumlah bakteri, agar para praktikan mengetahui cara menghitung jumlah bakteri dan tekniknya.

B.    Rumusan Masalah

1. Apa tujuan dilakuannya pengenceran?
2. Apa saja metodeyang digunakan dalam perhitungan bakteri?
3. Apa keuntungan atau kekurangan  metode  ALT?
4. Jenis air apa saja yang digunakan dalam praktikum?
5. Apakah setiap air mempunyai jumlah atau perhitungan mikroba yang sama ?

C.   Tujuan

1. Mempelajari teknik dilution (pengenceran).
2. Melakukan teknik perhitungan dengan metode TPC (Total Plate Count) atau ALT (Angka Lempeng Total).
3. Menghitung bakteri dengan metode MPN (Most Probable Number).

D.    Manfaat

1. Dapat memahami maksud pengenceran
2. Dapat melakukan serial pengenceran
3. memahami teknik menghitung mikroba.
4. Dapat membedakan teknik menghitung mikroba antara TPC/ALT dan MPN.
5. Mengetahui keuntungan dan kelemahan setiap metode yang digunakan
6. Dapat menghitung jumlah mikroba dengan rumus yang ditentukan

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

A.    Landasan teori

Air merupakan zat yang mutlak bagi setiap makhluk hidup. Dan kebersihan air adalah syarat utama bagi terjaminnya kesehatan

Menurut tempatnya, air dapat berada di permukaan tanah-selanjutnya air ini disebut air permukaan, dan dapat pula berada di dalam tanah, dan selanjutnya air ini disebut air tanah. Air hujan yang jatuh ke tanah sebagian meresap ke dalam tanah dan sebagian lain menggenang dipermukaan anah. Hal ini bergantung pada kondisi tanah. Air hujan membawa serta mikroorganisme-mikroorganisme yang senantiasa berhamburan di udara, lebih-lebih di udara yang mengatasi tanah yang berdebu. Setiba ditanah, air menjadi lebih cemar lagi karena sisa-sisa makhluk hidup (sampah), kotoran dari hewan maupun manusia, dan mungkin juga kotoran yang berasal dari pabrik-pabrik

Pertumbuhan mikroorganisme dapat diukur berdasarka konsentrasi sel ( jumlah sel per satuan isi kultur ) ataupun densitas sel ( berat kering dari sel-sel per satuan isi kultur ). Dua parameter ini tidak selalu sama karena berat kering sel rata-rata bervariasi ada tahap berlainan dalam pertumbuhan kultur. Edua pparameter tersebut tidak bermaksa sama dalam penelitian mengenai biokimia miroorganisme atau gizi mikroorganisme. Densitas sel adalah kuantitas yang lebih bermakna, sedangkan dalam penelitian mengenai inaktivasi mikroorganisme, konsentrasi sel adalah kuantitas yang bermakna.

Pertumbuhan mikroorganisme dapat diukur dengan dua cara yaitu secara langsung dan tidak lansung. Pengukuran pertumbuhan mikroorganisme secara langsung dapat dilakukan dengan beberapa cara yaitu:

a.         Pengukuran dengan metode Lempeng (The Viable Plate Count).

Pada metode ini dibuat seri pengenceran suspensi bakteri ataupun sampel yang kemudian ditanamkan pada media pertumbuhan padat yang sesuai. Prosedur pengenceran yang benar sangat berpengaruh pada keseluruhan proses perhitungan. Jumlah koloni yang dinyatalan dengan angka adalah yang berkisar antara 30-300 dan ada juga yang menyebutkan 25-250 koloni per cawan. Jika lebih dari 300 koloni, dinyatakan dengan TNTC (too numerous to count) atau TBUD (terlalu banyak untuk dihitung), dan jika kurang dari 30 dinyatakan dengan TFTC (too few to count) atau TSUD (terlalu sedikit untuk dihitung). Kelemahannya, membutuhkan waktu yang lama karena adanya proses inkubasi, menggunakan peralatan gelas yang banyak dan serta adanya faktor-faktor kesalahan yang sangat mungkin terjadi seperti kesalahan dalam penenceran, pipeting dan proses transfer. Dan keuntunganya adalah sederhana, mudah dan sensitive karena menggunakan coloni counter sebagai alat hitung dan dapat digunkan untuk menghitung mikroorganisme pada sampel makanan, air, ataupun tanah.

b.         Pengukuran menggunakan bilik hitung ( counting chamber )

Dimana disebut juga dengan metode langsung ( Direct Count Procedure ) . pada pengukuran inlah populasi mikroorganisme yang digunakan harus banyak  untuk bateri digunakan bilik hitung Petroff-Hausser, sedangkan untuk mikroorganisme eukariot digunakan Hemositometer. Keuntungan menggunakan metode ini adalah mudah, murah dan cepat, serta bisa diperoleh informasi tentang ukuran dan morfologi mikroorganisme. Kerugiannya adalah populasi mikroorganisme yang digunakan harus banyak  ( minimum berkisar 10⁶ CFU / ml ), karena pengukuran dengan volume dalam jumlah sedikit tidak dapat membedakan antara sel hidup dan sel mati, serta kesulitan menghitung sel yang motil .

c.      Pengukuran menggunakan Electronic counter

                  Pada pengukuran ini suspensi mikroorganisme dialirkan melalui lubang kecil ( oriice ) dengan bantuan aliran listrik. Elektroda yang ditempatkan pada dua sisi orifice mengukur tahanan listrik ( ditandai dengan naiknya tahanan ) pada saat bakteri melalui orifice. Pada saat inilah sel terhitung. Keuntungan dari metode ini adalah hasil bisa diperoleh dengan lebih cepat dan lebih akurat, serta dapat menghitung sel dengan ukuran besar. Kerugian dari metode ini adalah tidak bisa menghitung bakteri karena adanya gangguan debris, filament dan sebagainya, serta tidak dapat membedakan antara sel hidup dan sel mati.

d.      Pengukuran dengan Metode Angka Paling Mungkin/APM (Most Probable Number Procedure/MPN).

Metode angka paling mungkin adalah suatu metode statistik berbasis teori probabilitas/kemungkinan. Teknik memperkirakan jumlah mikroorganisme viabel dalam suatu sampel/contoh. Teknik MPN didasarkan pada statistik kemungkinan (probabilitas) dan hasil analisis MPN secara langsung berkaitan dengan frekuensi/banyaknya seri hasil pengujian yang positif (sampel menunjukkan adanya pertumbuhan mikroorganisme). Teknik ini dilakukan dengan membuat seri pengenceran suspensi bakteri bertingkat dalam sejumlah tabung berisi media cair (biasanya digunakan 9 tabung atau 15 tabung dalam 3 kelompok tingkat pengenceran). Untuk mendeteksi hasil pengujian yang positif dapat diamati dari timbulnya kekeruhan/turbiditas, terjadinya pembentukan produk metabolit akhir seperti adanya gas dalam tabung Durham, pembentukan asam/basa, dan lain-lain. Deteksi ini dilakukan setelah masa inkubasi berakhir. Pola positif/negatif dari hasil uji digunakan untuk memperkirakan konsentrasi bakteri dalam sampel dengan cara membandingkan pola tersebut dengan suatu tabel statistik probabilitas jumlah paling mungkin untuk hasil tersebut.

e.      Pengukuran dengan mengguakan teknik filtrasi membrane ( membrane filtrastion technique )

Pada metode ini sampel dialirkan pada suatu system filter membrane dengan bantuan vacuum. Bakteri yang terperangkap selanjutnya ditumbuhkan pada media yang sesuai dan jumlah koloni dihitung. Keuntungan metode ini adalah dapat menghitung sel hidup dan system perhitungannya langsung , sedangkan kerugiannya adalah tidak ekonomis.

f.       Pengukuran kekeruhan / turbiditry

Bakteri yang bermultiplikasi pada media cair akan menyebabkan media menjadi keruh. Alat yang digunakan untuk pengukuran adalah spektrofotometer atau kolorimeter dengan cara membandingkan densitas optic antara media tanpa pertumbuhan bakteri dan media dengan pertumbuhan bakteri

BAB III

METODOLOGI

A.  Alat dan bahan

Alat

·           Tabung reaksi

·           Cawan petri steril

·           Tabung reaksi

·           Pipet volume steril

·           Pembakar bunsen

·           Spuit 1 ml

·           Shaker ( vortex )

·           Incubator

Bahan

·           Larutan pengencer LDF

·           Media NA, PDA, dan TSB

·           Indikator phenol red dan tabung  durham

·           Sampel uji : Air PAM, Air mineral, Air aquarium

B.         Cara kerja

1.    Membuat seri pengenceran dan menghitung jumlah mikroba dengan teknik ALT:

·         Bekerja secara aseptic dengan 2 buah nyala api pembakar bunsen

·         Siapkan kultur bakteri 24 jam dalam Nutrient Broth atau sampel yang akan dianalisa

·         Disiapkan sampel yang akan dianalisa. Ditimbang 5 ml atau 5 gram sampel dimasukkan ke dalam 45 ml larutan pengencer (diperoleh pengenceran 10^-1).

·         Dibuat serial dilution, dengan menginokulasikan 1 ml suspensi di atas ke dalam 9 ml larutan pengenceran (diperoleh pengenceran 10^-2).

·         Dibuat serial dilution seperti ini hingga diperoleh larutan dengan pengenceran 10^-6.

·         Catatan, sebelum diinokulasikan ke dalam tabung pengencer berikutnya hendaknya dihomogenkan.

·         Secara aseptik, diambil masing-masing serial pengenceran sebanyak 1 ml suspensi kultur dari hasil pengenceran 10^-1-10^-6, dimasukkan ke dalam cawan steril. Untuk catatan, cawan steril hendaknya diberi label sesuai dengan seri pengenceran terakhir. (10^-5, 10^-6, 10^-7, 10^-8).

·         Dituangkan NA steril bersuhu ± 45 atau media lainnya kurang lebih 15 ml. (biasanya 100 ml media agar dapat digunakan untuk untuk 8 buah cawan). Segera sebelum media menjadi keras, dihomogenkan dengan menggoyangkan cawan dengan arah gerakan seperti menulis angka 8.

·         Dibiarkan hingga memadat. Diinkubasikan semua cawan dalam inkubator bersuhu 35-37 selama 18-24 jam dengan posisi terbalik. Jika kita menghitung untuk angka kapang khamir, diinkubasikan pada suhu 20-25 selama 3-5 hari.

·         Diamati pertumbuhan koloni dan dihitung jumlah koloni yang tumbuh pada masing-masing media agar cawan. Dibuatlah tabel pengamatan.

2.    Membuat serial pengenceran dan menghitung jumlah mikroba dengan teknik Most Probable Number (MPN):

·           Disiapkan 14 tabung yang telah berisi 9 ml media TSA steril. Dibagi ke dalam 4 kelompok (kelompok I dan II terdiri dari 4 buah tabung, kelompok III dan IV terdiri dari 3 buah tabung).

·           Pipet 1 ml larutan/sampel, diinokulasikan ke dalam masing-masing tabung kelompok I. Dengan demikian kelompok I ini masing-masing tabung mengandung sampel sebanyak 10^-1.

·           Diambil 1 tabung kelompok I, pipet 1 ml larutan dari seri pengenceran ini, diinokulasikan ke dalam masing-masing tabung reaksi kelompok II. Dengan demikian diperoleh konsentrasi pengenceran 10^-2.

·           Diambil 1 tabung kelompok II, pipet 1 ml larutan dari seri pengenceran ini, diinokulasikan dalam masing-masing tabung reaksi kelompok III. Dengan demikian diperoleh konsentrasi pengenceran 10^-3.

·           Kelompok IV digunakan sebagai blangko.

·           Diinkubasikan seluruh tabung pada inkubator bersuhu 35-37 selama 24-48 jam.

·           Diamati adanya pertumbuhan mikroba yang ditandai dengan kekeruhan dan terbentuknya gas dalam tabung Durham pada masing-masing tabung. Blangko idealnya tidak menunjukkan pertumbuhan.

·           Dengan menggunakan tabel MPN dapat dihitung jumlah bilangan duga terdekat jasad renik tiap gram atau tiap ml sediaan yang diperiksa.

BAB IV

HASIL PENGAMATAN DAN PEMBAHASAN

A.    Hasil Pengamatan

Waktu Inkubasi 14.00 WIB

·         Angka total lempeng ( ALT ) dengan menggunakan air kolam

No	Pengenceran	Jumlah Koloni
1	10-1	72
2	10-2	19
3	10-3	3
4	10-4	TBUD
5	10-5	TBUD
6	10-6	2

∑C

N =  ─────────────────

[(1 x n1) + (0.1 x n2)  x (d)]

           

                                                                        72

N =  ─────────

[(1 x 1) x(10^-1)]

72

N =  ─────

                                       0,1                  

N = 720 CFU/ml

·         Metode Angka Paling Mungkin ( MPN )

Pengenceran	Tabung Reaksi			Jumlah Koloni ( MPN/g )
	I	II	III
10-1	+	+	+	11OO
10-2	+	+	+
10-3	+	+	-

Jenis sampel : Air kantin

ALT                                                                                         MPN

No	Pengenceran	Jumlah Koloni
1	10-1	169
2	10-2	257
3	10-3	253
4	10-4	77
5	10-5	64
6	10-6	19

Pengenceran	Tabung reaksi			Jumlah Koloni (NPM/g)
	I	II	III
10-1	+	+	+	1100
10-2	+	+	+
10-3	+	+	+

Jenis sampel : Air mineral "Alfamart"

MPN

Pengenceran	Tabung reaksi			Jumlah Koloni (NPM/g)
	I	II	III
10-1	-	-	-	< 3
10-2	-	-	-
10-3	-	-	-

Jenis sampel : Air galon isi ulang

ALT                                                                                         MPN

No	Pengenceran	Jumlah Koloni
1	10-1	86
2	10-2	2
3	10-3	3
4	10-4	2
5	10-5	1
6	10-6	1

Pengenceran	Tabung reaksi			Jumlah Koloni (NPM/g)
	I	II	III
10-1	+	-	+	15 MPN/g
10-2	-	+	-
10-3	-	-	-

Jenis Sampel : Air PAM Depok

ALT                                                                                         MPN

No	Pengenceran	Jumlah Koloni
1	10-1	84
2	10-2	223
3	10-3	85
4	10-4	50
5	10-5	4
6	10-6	3

Pengenceran	Tabung reaksi			Jumlah Koloni (NPM/g)
	I	II	III
10-1	+	+	+	1100 MPN/g
10-2	+	+	+
10-3	+	+	+

Jenis sampel : Air bak FFUP

ALT                                                                                         MPN

No	Pengenceran	Jumlah Koloni
1	10-1	50
2	10-2	14
3	10-3	TSUD
4	10-4	8
5	10-5	TSUD
6	10-6	9

Pengenceran	Tabung reaksi			Jumlah Koloni (NPM/g)
	I	II	III
10-1	+	+	+	3MPN/g
10-2	+	+	+
10-3	+	+	+

                                         

Jenis sampel : air Jakarta Barat

ALT

No	Pengenceran	Jumlah Koloni
1	10-1	41
2	10-2	TSUD
3	10-3	TBUD
4	10-4	34
5	10-5	9
6	10-6	TSUD

 A.    Pembahasan

Pada perhitungan mikroba dengan menggunakan metode Angka Total Lempeng dengan pengenceran 10^-1, 10^-2, 10^-3, 10^-4 10^-5, 10^-6, menghasilkan jumlah koloni yang berbeda beda. Pada pengenceran 10^-1  dengan jumlah koloni 72. Sehingga dapat di hitung dengan menggunakan rumus

∑C

N =  ─────────────────

[(1 x n1) + (0.1 x n2)  x (d)]

Karena pengenceran tersebut menunjukkan jumlah koloni atau range antara 30-300. Dengan jumlah koloni per ml = N = 720 CFU/ml. Pada pengenceran 10^-2 dengan jumlah koloni 19, pada pengenceran 10^-3 dengan jumlah koloninya 3, pada pengenceran 10^-4 dengan jumlah koloni lebih dari 300 atau disebut juga dengan TBUD ( terlalu banyak untuk dihitung ). Pada pengenceran 10^-5   dengan jumlah koloni lebih dari 300 atau disebut juga dengan TBUD ( terlalu banyak untuk dihitung ). Pada pengenceran 10^-6  dengan jumlah koloninya dua. Dimana jenis air yang digunakan yaitu air kolam

      Pada perhitungan mikroba dengan menggunakan teknik Most Probable Number (MPN) mempunyai ertimbuhan mikroba yang berbeda beda yang terdiri dari tiga pengenceran yaitu 10^-1, 10^-2, 10^-3 , dimana setiap pengenceran terdiri dari 3 tabung reaksi. Pada pengenceran 10^-1 , ketiga tabung reaksi tersebut menghasilkan reaksi positif ( + ) yang ditandai dengan terjadinya perubahan warna, kekeruhan maupun adanya gelembung gas pada tabung durham. Pada pengenceran 10^-2 , ketiga tabung reaksi tersebut menghasilkan reaksi positif ( + ) yang ditandai dengan terjadinya perubahan warna, kekeruhan maupun adanya gelembung gas pada tabung durham. Pada pengenceran 10^-3  dimana tabung pertama dan kedua mempunyai reaksi positif ( + ) yang ditandai dengan adanya perubahan warna, adanya kekeruhan dan terbentuknya gas didalam tabung durham, sedangkan pada tabung ketiga menghasilkan reaksi negatif ( - ) karna tidak adanya perubahan warna, tidak terjadi kekeruhan dan tidak adanya gelembung gas pada tabung durham. Pada ketiga pengenceran tersebut mempunyai jumlah koloni yang sama yaitu 1100 MPN/g yang dapat dilihat dari table MPN untuk 3 seri tabung. Dengan menggunakan air kolam

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

A.    Kesimpulan yang dihasilkan dari preaktikum tentang perhitungan mikroba adalah:

1.    Tujuan dari pengenceran adalah pada setiap sample adalah untuk memperkecil atau mengurangi jumlah mikroba yang tersuspensi dalam cairan sehingga membantu untuk mempermudah perhitungan jumlah mikroba

2.    Metode yang dilakukan dalam perhitungan bakteri diantaranya: Pengukuran dengan metode Lempeng (The Viable Plate Count), Pengukuran menggunakan bilik hitung ( counting chamber ), Pengukuran menggunakan Electronic counter, Pengukuran dengan Metode Angka Paling Mungkin/APM (Most Probable Number Procedure/MPN), Pengukuran dengan mengguakan teknik filtrasi membrane ( membrane filtrastion technique ), Pengukuran kekeruhan / turbiditry

3.    Kerugian dan keuntungan Pengukuran dengan metode Lempeng (The Viable Plate Count). Keruguan Membutuhkan waktu yang lama karena adanya proses inkubasi, menggunakan peralatan gelas yang banyak dan serta adanya faktor-faktor kesalahan yang sangat mungkin terjadi seperti kesalahan dalam penenceran, pipeting dan proses transfer. Dan keuntunganya adalah sederhana, mudah dan sensitive karena menggunakan coloni counter sebagai alat hitung dan dapat digunkan untuk menghitung mikroorganisme pada sampel makanan, air, ataupun tanah.

4.    Jenis air yang digunakan pada saat praktikum diantaranya: air kolam ikan, air kamar mandi, air kantin, air mineral dll

5.    Jumlah perhitungan  bakteri yang dihasilkan di setiap jenis air berbeda, tergantung air yang digunakan ataupun jumlah bakteri yang terdapat dalam air.

6.    Pada teknik angka total lempeng ( ALT ) didapatkan hasil jumlah koloni per ml =

N = 720 CFU/ml.       

B.    Saran

1.    Pengguanaan waktu yang lebih efisien lagi

2.    Dalam pelaksanaan praktikum dilakukan dengan lebih teliti, lebih aseptis lagi agar hasil pengamatan terbaca.

3.    Penggunaan mikropipet yang harus hati-hati.

4.    Serta peningkatan tanggung jawab yang lebih baik lagi dari semua segi aspek, agar mutu pengajaran dan pembelajaran semakin meningkat.

BAB VI

DAFTAR PUSTAKA

·           Pratiwi, Sylvia T. 2008. Mikrobiologi Farmasi. Jakarta: Erlangga. Hal 107-110

·           Capuccino,  J.G & Sherman, N. 1992. Microbiology a Laboratory Mannual. USA: The Benjamin/Cummings Publish. Hal 458.

LAMPIRAN

Sebelum inkubasi

                        METODE MVN                                                                                   METODE ALT

          

Setelah inkubasi

METODE ALT

                               

                      

                             

METODE MVN